Leptospirose - PCR (Sangue)

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Definição: A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês Polymerase Chain Reaction (PCR), é uma metodologia molecular de detecção direta do agente etiológico da leptospirose, que tem a finalidade de detectar genes específicos do material genético (DNA) do gênero Leptospira e de espécies bacterianas patogências, em amostras clínicas como sangue, líquor, urina e tecidos (ante ou post mortem ).

Sinônimos: Leptospira interrogans - PCR (Sangue); Leptospira - PCR (Sangue); Leptospira spp. - PCR (Sangue); Leptospirose - Reação em Cadeia da Polimerase (Sangue); Leptospirose - Polymerase Chain Reaction (Sangue) ; Leptospirose - DNA (PCR - Sangue); Leptospirose - PCR em tempo real (Sangue); Leptospirose - RT-PCR (Sangue); Leptospirose - Teste Molecular (PCR - Sangue).

Introdução

A leptospirose é uma zoonose de distribuição e importância mundial, mais frequente em países tropicais e subtropicais. No Brasil, ela é endêmica em várias regiões, com picos epidêmicos em períodos chuvosos.

É uma doença infecciosa febril de início abrupto, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, que são transmitidas para os humanos (hospedeiro terminal e acidental da doença) através do contato, direto ou indireto, com a urina de animais reservatórios (em áreas urbanas, notadamente de ratos) ou alimentos, água e lama contaminados pela bactéria.

Foram descritos mais de 200 sorovares patogênicos, divididos em cerca de 25 sorogrupos de bactérias do gênero Leptospira . Essas leptospiras se mantém na natureza nos túbulos renais de certos animais, principalmente roedores (especialmente ratos de esgoto), mas também em bovinos, ovinos, suínos, equinos e cães.

Após a penetração no corpo humano (pela pele com lesões ou íntegra se muito tempo imersa em água, ou mucosas), as leptospiras caem na circulação, invadindo praticamente todos os tecidos e órgãos do organismo, sendo posteriormente removidas pelo sistema imune. Todavia, elas podem se estabelecer nos túbulos renais, sendo liberadas na urina por um período de semanas a meses.

Seu período de incubação varia, geralmente, entre 5 e 14 dias, e seu quadro clínico apresenta um amplo espectro de manifestações inespecíficas (ex.: febre, artralgia, mialgia, cefaleia, tosse, diarreia, anorexia, náuseas/vômitos, hiperemia/hemorragia conjuntival, dor ocular, exantema), variando desde quadros assintomáticos/oligossintomáticos a formas graves (ex.: Síndrome de Weil) e potencialmente letais.

Devido a sua diversidade de apresentações clínicas, a leptospirose pode ser confundida com outras doenças, como dengue, influenza, malária, hepatites e rickettisioses, por exemplo. Dessa forma, exames laboratoriais para a detecção do agente etiológico (ex.: PCR, isolamento viral) ou de anticorpos específicos (ex.: ELISA-IgM, microaglutinação - MAT ) são importantes para o auxílio diagnóstico.

A escolha do teste diagnóstico depende da fase evolutiva da doença. Na primeira semana (fase aguda ou fase leptospirêmica), os métodos de detecção da bactéria (PCR e isolamento), em fluídos como o sangue, são os de eleição, já que nessa fase inicial as espiroquetas são encontradas na circulação.

Já a partir da segunda semana (fase tardia ou imune) ocorre a soroconversão, período da doença onde as concentrações de anticorpos elevam-se no sangue e, dessa forma, os testes sorológicos (ELISA-IgM, microaglutinação - MAT ) ganham destaque.

Essa soroconversão costuma ocorrer cerca de 5-7 dias após o início dos sintomas mas, em alguns casos, verifica-se apenas após o 10 ^o dia ou mais. O pico da produção de anticorpos é observado, usualmente, a partir do 14 ^o dia de doença.

A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês Polymerase Chain Reaction (PCR), é uma metodologia molecular de detecção direta do agente etiológico da leptospirose, que tem a finalidade de detectar genes específicos do material genético (DNA) do gênero Leptospira e de espécies bacterianas patogências, em amostras clínicas como sangue, líquor, urina e tecidos (ante ou p ost mortem ).

Dado a evolução natural da doença, o período ideal de coleta do sangue (soro ou plasma) para a realização da PCR se dá ainda na fase aguda (leptospirêmica) da doença, do 1 ^o ao 7 ^o -10 ^o dia do início dos sintomas (preferencialmente nos primeiros 4 dias), período no qual as espiroquetas são encontradas na corrente sanguínea.

Por conta da dificuldade, complexidade técnica e menor acesso para a realização do isolamento viral, PCR ou cultura, a grande maioria dos diagnósticos laboratoriais de leptospirose são feitos através de exames sorológicos.

A cultura de leptospiras possui uma taxa muito baixa de sucesso e, portanto, não deve ser utilizada, via de regra, para o diagnóstico. Exames histopatológicos e de imuno-histoquímica também podem ser realizados, embora com menor acesso.

Solicitação

Indicações:

Diagnóstico precoce de leptospirose (fase leptospirêmica);
Direcionar o manejo clínico inicial, condicionado à confirmação posterior por microaglutinação (MAT) na fase tardia (imune);
Investigação de óbitos precoces que impedem a coleta de uma segunda amostra.

Como solicitar: Leptospirose - PCR (Sangue).

Orientações de Coleta

Orientações ao paciente: Não há a necessidade de nenhum preparo específico;
Tubo para soro (tampa vermelha/amarela) ou plasma EDTA (tampa roxa). Armazenar o material congelado (-20 ^o C) para o transporte. Se houver a necessidade de estocar a amostra por um período prolongado, armazená-la congelada (-20 ^o C, idealmente a -70 ^o C);
Material: sangue;
Volume recomendável: 1,0 mL.

Figura 1. Tubo para soro - tampa vermelha. Ilustração: Caio Lima

Figura 2. Tubo para soro - tampa amarela. Ilustração: Caio Lima

Figura 3. Tubo para soro - tampa roxa. Ilustração: Caio Lima

Valores de Referência

Não detectável.

Observação! A acurácia diagnóstica da PCR para leptospirose no sangue pode variar de acordo com o kit diagnóstico/protocolo utilizado.

Interferentes/Limitações

Devido a sua sensibilidade e alta especificidade diagnóstica (sorovar/sorogrupo), o Teste de Aglutinação Microscópica (MAT) é considerado, pela Organização Mundial da Saúde (OMS), o teste "padrão-ouro" de referência para a confirmação do diagnóstico sorológico da leptospirose.

Essa metodologia molecular apresenta uma maior complexidade técnica e necessidade de profissionais especializados à sua realização, apresentando, pois, uma menor disponibilidade de acesso, especialmente em regiões afastadas dos grandes centros.

Resultados falso-negativos (ex.: Inibidores de amplificação, transitoriedade das leptospiras nos fuídos biológicos) ou falso-positivos (ex.: Contaminantes ambientais) podem ocorrer.

Um resultado positivo deve ser confirmado com o Teste de Aglutinação Microscópica (MAT).

Esse exame não é capaz de identificar a espécie e/ou o sorovar infectante, informação importante em termos de vigilância epidemiológica.

A interpretação dos resultados obtidos pelas diferentes técnicas e tipos de exames laboratoriais para o auxílio diagnóstico da leptospirose deve ser cuidadosa, já que diversos fatores (ex.: limitações metodológicas, fase da doença/momento da coleta, cicatriz sorológica, uso de antibióticos, circulação de outras doenças), podem influenciar nos resultados. Dessa forma, sempre que possível, os exames devem ser avaliados de maneira complementar entre si, sempre correlacionados com a história epidemiológica, dados clínicos e resultados de outros exames.

Causas de Alteração

Detectável: Leptospirose aguda (fase leptospirêmica).

Não detectável: Indivíduos saudáveis; leptospirose recente (fase imune) ou passada.

Autoria

Autoria principal: Pedro Serrão Morales (Patologia Clínica e Medicina Laboratorial).

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